科学研究中，针对特定目的基因的表达分析是常见的实验环节，常用的方法包括实时荧光定量PCR（qRT-PCR）。在转录组分析后，很多研究者会选择进行qRT-PCR以验证二代测序结果的可靠性。下面将详细介绍Livak法（2^-∆∆Ct法）的计算过程，以及在qRT-PCR中常见的问题及其解决方案。
qRT-PCR的原理：以目的基因的cDNA为模板，通过PCR扩增过程检测荧光信号的变化。荧光信号的强度与扩增产物的数量成正比，从而可以得到相对定量基因表达水平的信息。qRT-PCR一般包括SYBR染料法和Taqman探针法等方法。
扩增曲线及溶解曲线对于评估实验结果至关重要。扩增曲线主要用于评估扩增引物的效率，而溶解曲线则可以用于检测是否存在非特异性扩增或引物二聚体等问题。
Livak法的详细步骤
1. 计算每个组内参基因（如ATCB）的Ct值均值。
2. 计算每组中目的基因（如OCA2）的Ct值与内参基因的Ct值之差（即∆Ct）。
3. 计算对照组（如wt组）中∆Ct值的均值，然后用处理组（如mut组）中每个样本的∆Ct值减去对照组的∆Ct均值，得到∆∆Ct值。
4. 根据处理组相对于对照组的∆∆Ct值计算相对表达量，即取2的负幂次方（2^-∆∆Ct）。
常见问题及解决方案
问题一：Ct值出现过晚
1. cDNA模板降解或cDNA模板浓度低：重新制备cDNA模板或减少cDNA模板稀释倍数进行重复实验。
2. 扩增效率低：优化引物或探针设计，确保其特异性，或调整PCR反应条件。
3. PCR体系中存在抑制物：确保样品制备过程中使用纯净试剂，提高RNA纯度，如A260/A280比值应大于2.0。
问题二：内参基因的Ct值正常，而目的基因的Ct值出现较晚
1. 目的基因表达水平较低：为准确测量目的基因的表达水平，可对内参基因和目的基因的模板进行分开稀释。
2. PCR扩增效率低：设计多对引物并选择最优的。
问题三：熔解曲线呈现非单一峰
1. 非特异性扩增：优化PCR反应条件，进行温度梯度PCR实验，尝试不同温度和延伸时间。
2. 引物二聚体：适当减低引物浓度以避免此问题。
3. 基因组污染：重新制备cDNA模板。
问题四：实验重复性差
1. 移液枪不准或加样不准确：更换性能更好的移液枪并定期校准。
2. PCR仪在不同位置温度不一致：为获取准确结果，应定期对定量PCR仪进行校准。
3. qRT-PCR预混液未混合均匀：轻轻颠倒离心管以促进混合，避免剧烈摇动或振荡。
