近年来，蛋白质组学研究成为了生物领域的热门方向，其中，Western Blot实验是蛋白组学研究中的基本实验操作。要获得成功的Western Blot实验结果，需要注意许多细节。
Western Blot，也称为蛋白质免疫印迹实验，利用抗原抗体特异性结合来检测目的蛋白的表达量。这种蛋白质检测技术现已广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个领域。它是由瑞士米歇尔弗雷德里希生物研究所的Harry Towbin在1979年提出的，并在尼尔·伯奈特的《分析生物化学》中首次被命名为Western Blot。
以下是每一步操作的详细介绍：
一、样品制备
样品中加入的Loading Buffer主要包含SDS（使蛋白质变性并带上负电荷）、甘油（增加样品密度，使样品沉降）、溴酚蓝（作为离子型染料，观察蛋白的迁移）和DTT（减少二硫键的形成）。
二、凝胶电泳
在配置SDS凝胶时，需遵循一定的原则：先配置分离胶，再配置浓缩胶；分子量越高，分离胶浓度越低；根据上样量选择合适的玻璃板和梳子。具体的配胶成分包括分离胶的不同浓度、浓缩胶、30%丙烯酰胺、4XSDS-PAGE浓缩胶和分离胶、10%过硫酸铵以及TEMED。
在电泳过程中，一般采用SDS-PAGE电泳，每孔上样量为20-50ng。样品先在80V电压下充分浓缩，到达分离胶后调整为120V，直至溴酚蓝接近跑出时终止电泳，然后进行转膜。
三、转膜
转膜主要分为使用PVDF膜和NC膜两种方法。PVDF膜结合能力强，但价格较贵；NC膜价格便宜，但结合能力较差，不能重复使用。转膜过程中需注意避免短路，可以使用冰袋散热以避免蛋白质降解。目前市面上有快速转膜液，可在常温下400mA转30min完成转膜。
四、封闭与抗体孵育
封闭一般采用5%的脱脂奶粉或BSA，目的是去除非特异性结合。一抗孵育后，用TBST洗膜，然后将对应的膜放入用一抗稀释液配好的抗体中，在4℃条件下孵育过夜。
五、显影与结果分析
转膜后可用丽春红染色检验转膜效率。将PVDF膜洗净后，滴加ECL发光液进行显影。
在Western Blot实验中，可能会遇到一些问题，如无显色信号、非特意性杂带和污点等。这些问题的原因可能包括抗原含量不足、制胶浓度比例不合适、转膜不完全、抗体浓度和匹配问题、显色系统灵敏度不足等。
列举了一些实验用品的品牌和货号，如无水乙醇、Tris醋酸、无菌水、二羟乙基甘氨酸、甲叉双丙烯酰胺和甘氨酸等。
